病理学会なう

病理学会で、発表した。ヒトES細胞の造腫瘍性について、未分化ES細胞を移植することに関し、質問を受けた。最終生産物（ES細胞製品）を移植するべきである。原材料を移植しても意味がない。山口大学教授と京都大学教授から、これで同じことを言われたことになる。ご指摘の通りなのです。ただ、こちらは、ご指摘の通りに行っているつもりでもあるのです。

作製したヒトES細胞は、SEESと呼びます。シーズと読みます。

種という意味です。本当の意味で

シーズになってくれるといいな。

ヒトES細胞の標準化 Identity 同一性

Guideline on human cell-based medicinal products by EMEA

London, 11 January 2007,

Doc. Ref. EMEA/CHMP/410869/2006

Identity

1. Cellular component

1.1 Phenotypic profiles

1.1.1 Relevant markers 

1.1.1.1 Gene expression

Oct-4/3, Nanog, Sox2

1.1.1.2 Biochemical activity

Alkaline phosphatase

1.1.1.3 Antigen presentation

Tra-1-60, Tra-1-81, 6E2, SSEA-3/4

1.1.1.4 Protein expression

Oct-4/3, Nanog, Sox2, E-cadherin: Present

T, Pax6, AFP: absent.

1.1.1.4 Response to exogenous stimuli (FGF dependence)

1.1.1.5 Capability to produce measurable molecules

1.1.2 Morphology

1.1.3 Growth (Population doubling time: up to 36 h)

1.2 Genotypic profiles

1.2.1Short tandem repeat.

1.2.2 HLA

1.2.3 Karyotype

1.2.3 Other genetic markers

2. Differentiation

2.1 in vitro differentiation (EB formation, etc)

2.2 Teratoma formation

3. Contamination

3.1 Bacteria, fungus, virus, yeast, mycoplasma.

3.2 Cells

他　参考文献

Carpenter, MK, et al., Developing safe therapies from pluripotent stem cells, Nat Biotechnol, 27(7):606, 2009.

胚性幹（ES）細胞臨床指針作成に向けた課題検討のための予備研究、平成19年度　総括研究報告書、主任研究者　中内啓光　分担研究者　梅澤明弘　p155

 

日本におけるヒトES、iPS細胞研究標準化：その１、古江ー楠田　美保、Tiss. Cult. Res. Commun. 27:139-147, 2008.

Andrews, PW, et al., The International Stem Cell Initiative: toward benchmarks for human embryonic stem cell lines. Nat Biotechnol, 23: 795, 2005.

Adewumi, O., et al., Characterization and culture of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol, 2007.

緑膿菌を使用した蛋白輸送

Candaceの論文をそのままコピペ。蛋白輸送に, P. Aeruginosaを使うっていう方法。細菌を使うリスクはあるけど、遺伝子は組み込まれないというメリットはある。フロリダ大学に行ったときに説明してくれた米国の研究者。Hans Scholerのところに武者修行に行ったと言っていた。菌が増えるのを抗生剤でうまいことコントロールすれば、とてもいろんなことに使用できるかもしれない。

PLoS One. 2011 Jan 27;6(1):e16465.

Bacterial delivery of nuclear proteins into pluripotent and differentiated cells.

Bichsel C, Neeld DK, Hamazaki T, Wu D, Chang LJ, Yang L, Terada N, Jin S.

Department of Molecular Genetics and Microbiology, College of Medicine, University of Florida, Gainesville, Florida, United States of America.

Abstract

Numerous Gram negative pathogens possess a type III secretion system (T3SS) which allows them to inject virulent proteins directly into the eukaryotic cell cytoplasm. Injection of these proteins is dependent on a variable secretion signal sequence. In this study, we utilized the N-terminal secretion signal sequence of Pseudomonas aeruginosa exotoxin ExoS to translocate Cre recombinase containing a nuclear localization sequence (Cre-NLS). Transient exposure of human sarcoma cell line, containing Cre-dependent lacZ reporter, resulted in efficient recombination in the host chromosome, indicating that the bacterially delivered protein was not only efficiently localized to the nucleus but also retained its biological function. Using this system, we also illustrate the ability of P. aeruginosa to infect mouse embryonic stem cells (mESC) and the susceptibility of these cells to bacterially delivered Cre-NLS. A single two-hour infection caused as high as 30% of the mESC reporter cells to undergo loxP mediated chromosomal DNA recombination. A simple antibiotic treatment completely eliminated the bacterial cells following the delivery, while the use of an engineered mutant strain greatly reduced cytotoxicity. Utility of the system was demonstrated by delivery of the Cre-NLS to induced pluripotent stem cells to excise the floxed oncogenic nuclear reprogramming cassette. These results validate the use of T3SS for the delivery of transcription factors for the purpose of cellular reprogramming.

同種の細胞移植って

現在行われている同種の細胞移植って。。。

骨髄移植---そもそも致死性の疾患に対して行われる。

脊髄損傷

age-relatedmacular degeneration

相当な病気、すなわち致死性疾患にのみ適応されると考えた方が早い。なんせ、免疫抑制剤を使用するわけであるから、それ以上の利益がなくてはならない。骨髄移植ほどの免疫抑制剤は使用しないだろうし、骨髄移植でのGvHDといった副作用は、細胞移植では存在しないが、それでも同種の細胞医療は重篤な疾患に限られるとういう考えが正しいだろう。致死性疾患といってもいいかもしれない。

骨髄間質が臨床応用された疾病

その昔、ブログで書いたかもしれない。

1. GvHD

2. Metachromatic leukodystrophy

3. 心筋への移植

4. 脳虚血

5. Scarless wound healing

6. 虚血下肢

西野論文タイトル

　論文タイトルは、「DNA methylation dynamics in human induced pluripotent stem cells over time」である。投稿したときは、 Periodic aberrant DNA hyper-methylation in human induced pluripotent stem cells in long-term cultivationであったのだが、内容は全く逆なのに同じようなタイトル（ Hotspots of aberrant epigenomic reprogramming in human induced pluripotent stem cellsというタイトルの雑誌と、Reference Maps of Human ES and iPS Cell Variation Enable High-Throughput Characterization of Pluripotent Cell Linesというタイトル）の論文がCell誌やNature誌に掲載されたので西野氏と相談してタイトルを変更した。

西野氏が、「iPS作製の秘密は、山中氏の確率モデルによって説明できる」ことを論文で発表する

山中氏が、Nature誌 (Nature, 460:49, 2009)にiPS細胞作製メカニズムに２つのモデルを提唱した。確率モデルとエリートモデルだ。宮崎大学の西野光一郎准教授は、成育の研究室にいたときに、確率モデルが正しいことをエピジェネティクス動態から証明した。エリートモデルでは、どの細胞もがiPS細胞になれるわけではなく、細胞集団の中でiPS細胞になることを潜在的に運命づけられた「エリート」細胞のみがiPS細胞に変身できる。一方、確率モデルでは、細胞集団のどの細胞もiPS細胞になることができ、iPS細胞になれるかなれないかは、メチル化の波が次々と生じることによっておき、そのメチル化部位は細胞ごとに全く異なり、確率的であった。運命づけられている訳ではなく、確率によって細胞の運命は左右されることになる。

　細かいことをいうと、西野氏の実験は山中4因子がサイレンシングされ、影響がなくなってからの話である。すなわち、山中4因子に依存しないフェーズでメチル化ダイナミズムが継続し、次々と新たなゲノム・メチル化を生じ、その中で偶然iPS細胞になれる形のメチル化を生じた細胞のみがiPS細胞になるということだ。また、その波は培養を続けるとだんだんと小さくなって最終的にはES細胞のように落ち着く。落ち着いてしまった後には、強烈なメチル化ダイナミズムは跡形もなくなっている。ゲノムメチル化を経時的に見ていった西野氏の努力と緻密さからこの発見はなされたと思う。

　この結果は、PLoS Geneticsに掲載予定だ。タイトルは掲載されてから紹介します。

Nishino's studies favor the stochastic model of theYamanaka model (Nature, 460:49, 2009) rather than the elite model. 

iPSの同一性

iPS細胞の標準細胞と言えば、最初に報告したという理由で、

201B由来のiPS細胞で、理化学研究所に寄託されている細胞って言うことになるのであろう。

201B7; Takahashi K, et al. Cell. 2007 Nov 30;131(5):861-72.
253G1; Nakagawa M, et al.Nat Biotechnol. 2008 Jan;26(1):101-6.

Cell, 131:861, 2007の図から追っていこう。

iPS細胞であると言う証明は以下の項目を決めておく必要があるとされる（のか）。また、iPS細胞の同一性を言うためには、以下の項目を押さえる必要があるのだろう。

１．形態

２．免疫組織化学（SSEA-3, SSEA-4, Tra-1-60, Tra-1-81, Tra-2-49/6E)

３．RT-PCRとウェスタン（内在Oct-4/3, 内在Sox2, Nanog等）

４．プローモータ領域のメチル化（Oct-4/3, nanog, Rex1)　メチル化率が半分以下か。

５．不死化

６．EB形成による分化

７.  奇形腫形成

方法も同様に論文と同じものとするべきだろう。奇形腫形成は、SCIDマウスを論文では使用しているが Balb/c nu/nuでも問題ないと思う。

一方、ES細胞については、Rao氏らがES細胞の標準化を進めているわけであるから、それに従うのが一番である。世界的に認められているわけだからね。結論から言えば、iPS細胞と同じなのだろうが、具体的に記述しなくてはいけないだろう。

Immunocytochemistry

Tar-1-60

Tar-1-81

SSEA-3/4

Oct-4/3

Methylation pattern of the promoters of the Oct-4/3, Nanog, and Sox-2 genes

Morphology

Teratoma formation at 4 weeks after implantation into nude mice